例如，ChRs在可见光区有较宽的激活光谱并且须要较高强度的光激活(~1mW mm-2)。由于ChRs是天然的低导通道，须要在神经元的质膜中表达105-106个功能性ChRs，才能介导足够的光依赖性去极化和勾引神经元激活；在老鼠脑中，激活ChRs须要距目标细胞群100μm以内发射1-15 mW光以确保引起动作电位，这限定了光依赖激活脑组织的体积(~1 mm3)。在不须要植入侵入性光纤进行光传输的情形下，发明高光敏感度和高光电流的光遗传离子通道蛋白以激活更大容量的脑组织迫不及待。
2019年10月14日，加州理工学院Viviana Gradinarua和Frances H. Arnold实验室在Nature Methods杂志上揭橥了题为Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics的论文。文章利用了机器学习的方法，即利用大量的ChR变异体文献，为设计高性能的ChRs演习统计模型。
在有限的102个有功能特性的ChRs实验组演习高斯过程模型，设计了高光敏度和高光电流的ChRs。个中三个突变体，即ChRger1-3，在无光纤植入的情形下，光勾引即可使神经元愉快，也便是说，这种光敏感通道蛋白使经颅光遗传学成为可能。
光遗传学研究离不开病毒，病毒可将表达光敏感通道蛋白的DNA传送到神经细胞中，大部分实验依赖于侵入性的颅内病毒通报，而通过尾静脉注射病毒进而特异传染神经细胞起到通报目的基因的方法在传统光遗传学中运用甚少，由于全身性注射病毒，神经细胞传染病毒量较少，表达ChR2的量不敷以介导光依赖性去极化产生动作电位。
ChRger1-3高光敏度和高光电流，少量表达就足以介导光依赖性的动作电位。以下实验结果便是作者利用全身性通报特异传染神经系统的病毒（病毒外壳蛋白是rAAV-PHP.eB）的办法验证ChRger1-3的特性。
作者利用了光遗传学颅内自刺激腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元的行为学范式来评估ChRger2的光遗传效率。作者将rAAV-PHP.eB包装的双flox包含ChRger2或ChR2 (H134R)的倒开放阅读框的病毒全身注射到Dat-Cre老鼠(图a和b)。
3周后立体定位植入光纤套管到腹侧被盖区上方，把老鼠放在一个自刺激操作盒，条件性勾引使它们通过鼻子触发447nm激光。表达ChRger2的动物以频率依赖和激光功率依赖的办法表现出强健的光遗传自我刺激。激光频率越高(高达20hz)和功率越高(高达10mw)则促进更大的操作相应率(图c)。相反，激光刺激不能增强表达ChR2(H134R)的动物的操作反应(图c)。
这些结果与急性切片的结果同等，在急性切片中，ChR2(H134R)的光勾引电流较弱，由于其全身性注射病毒，ChR2低拷贝数不敷以介导光依赖性去极化产生动作电位。
为了确定ChRger2是否能够同时实现微创转基因通报和微创光引发，作者用rAAV-PHP.eB 包装CaMKIIa启动子驱动转录的ChRger2或ChR2(H134R)病毒全身性传染小鼠，检测皮质愉快性锥体神经元的转基因表达(图d)，接着通过对传染病毒老鼠的右侧第二运动皮层(M2)进行无创性光刺激来测试自由运动的动物的运动定向掌握。
在实验中，M2单侧刺激可以毁坏了对侧下肢的运动功能，导致小鼠偏离刺激侧。只管颅盖骨的存在引起光散射，用20mW447nm的光刺激可使表达ChRger2的动物发生左转行为，但表达ChR2(H134R)的动物在接管光刺激时则没有发生左转行为(图f)。并且停滞光刺激时，发生左转行为的老鼠停滞左转。即便光强度低至10 mW，小鼠的光刺激勾引左转行为仍会发生。
为了确保小鼠的转向行为不是由于视觉刺激或激光引起的热刺激所致，作者利用671nm的光源重复了实验，671nm在两个光敏感蛋白的引发光谱之外。20mw671nm的光不能勾引表达ChRger2和ChR2(H124R)的老鼠转向(图g)。总的来说，这些实验表明，ChRger2可用于全身性基因通报，能够实现微创的光遗传愉快。
参考文献：
Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics.
作者信息
编译作者：济沧海（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
