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«——【 ·序言· 】——»
组装在质膜内叶上的整合素粘附复合物介导细胞对细胞外基质蛋白的粘附并激活一系列旗子暗记通路。
虽然液-液相分离已被提出作为勾引新生粘附组装的机制，但膜组成如何塑造在生理条件下发生的相分离仍未探索。
本研究聚焦于脂质膜上重组新生整合素簇的表面勾引相分离征象，证明了含有脂质膜的磷酸肌醇勾引最小的新生粘附缩合物。
表明膜表面设定了有效的局部溶剂条件和多价蛋白质相互浸染的稳定性。
这种效应可实现粘附复合物形成所需的特定膜干系相分离，有助于揭示整合素簇的功能机制，为生物膜界面研究供应了新的视角和进展。
«——【 ·材料和试剂· 】——»
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、三，三（2-羧乙基）膦（TCEP）、过氧化氢（H2O2）、硫酸（H2SO4）、咪唑、氢氧化钠、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸、氯化钾、氯化锌、叠氮化钠（NaN3）、柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、Atto647NHS酯、二硫苏糖醇（DTT）、葡萄糖、吡喃糖氧化酶（PO）和过氧化氢酶（C）。
DOPC（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、DGS-NTA-Ni（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰基]（镍盐））、PEG2000-PE（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐））、PI（4，5）P2（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-（1'-肌醇-4'，5'-二磷酸）（铵盐））和1，2-二十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
«——【 ·蛋白表达和纯化· 】——»
通过高分辨率完全质谱，合成并纯化了阿托647-标记的6-β1整合素细胞质肽，以确保肽序列的精确性。
对Kindlin-2和帕西林进行表达和纯化，采取N末端his-sumo标签以实现可溶性表达，并在大肠杆菌（DE3）Rosetta2中进行表达。
细胞裂解后，利用Ni-NTA固定化金属亲和色谱（IMAC）捕获蛋白质，并通过SenP2酶切去除相扑标签，Ni-NTA珠下拉，经由尺寸排阻色谱的终极纯化步骤。
talin-47蛋白在大肠杆菌（DE3）Rosetta2中通过0.2mM IPTG在18°C下过夜勾引表达，裂解后利用IMAC电泳缓冲液进行超声裂解。
打消裂解物后，HisTrapHP Ni-NTA IMAC色谱柱进行纯化，用IMAC电泳缓冲液洗涤，逐步梯度洗脱。
用6mM Tris（pH 10.3）、290.9mM NaCl和20mM TCEP作为电泳缓冲液，将洗脱级分合并、浓缩，并通过Superose 7增加8/200 GL尺寸排阻色谱进一步纯化。
利用Gateway克隆技能将带有N末端his-sumo标签的小鼠局灶性粘附激酶克隆到PB-T-Rfa中，以建立稳定的表达FAK的HEK293T细胞系。
细胞在FreeStyle 293表达培养基中培养，通过多西环素勾引蛋白质表达。
细胞经离心网络后，在IMAC电泳缓冲液中超声裂解，通过Ni-NTA IMAC色谱柱进行纯化，终极通过尺寸排阻色谱进一步纯化。
通过SDS-PAGE、高分辨率完全质谱、紫外/可见光谱和动态光散射等技能对所有蛋白质制备物的完全性和纯度进行了掌握和验证。
«——【 ·流动室准备· 】——»
利用三层封口膜将尺寸为40mm×22mm的盖玻片固定在尺寸为25毫米×75毫米的显微镜载玻片上，以用于测定。
将盖玻片经由30M NaOH的超声处理3分钟，并在洗濯前利用2：1的H2SO4/H2O2溶液进行10分钟的处理，然后用MilliQ水进行冲洗，以使其表面变得亲水。
经由清洁的盖玻片再次进行冲洗，并储存在MilliQ水中，显微镜载玻片在30%wt Hellmanex水溶液中超声处理2分钟。
用MilliQ水进行冲洗，并在储存前放置在乙醇中，经由清洁处理的盖玻片和显微镜载玻片在72小时内利用。
«——【 ·膜系统重构模型· 】——»
在流动室内，制备支持的脂质双层（SLB），将小单体脂质囊泡（SUV）以终极脂质浓度0.167mM加入腔室中，在室温下分裂，使其在玻璃表面上形成SLB，持续20分钟，用1.6mL HEPES缓冲液和5% PIP洗涤SLB。
利用49.0mL柠檬酸缓冲液洗涤，后用0.8mL HEPES缓冲液洗涤，以去除多余的脂质体，为了评估膜的流动性，还加入了DHPE，值得把稳的是0%和5%点的流动性膜相同。
在HEPES缓冲液中与1μM荧光标记的β1整合素共孵育120分钟之后，利用0.8mL HEPES缓冲液进行洗涤，将与β1整合素结合的SLB与不同的蛋白质稠浊物一起孵育。
该蛋白质稠浊物中包含8U/mL的过氧化物酶（PO）、1.7kU/mL的催化剂（C）和36mM的葡萄糖，以充当除氧系统，以防止荧光成像过程中蛋白质的变性和光漂白。
«——【 ·成像和数据采集· 】——»
在徕卡DMi47显微镜上利用带有HCPLAPO8x/100.1油浸物镜，搭配ORCA-Flash4.0CMOS相机（C13440-20CU），进行连续图像记录以追踪冷凝水动力学。
同时利用徕卡无限远扫描仪单元进行光漂白（FRAP）实验，以不雅观察荧光规复过程，在图像剖析方面，采取斐济/ImageJ软件来评估β1整合素簇的密度和大小。
«——【 ·果仁2-膜上整合素簇· 】——»
我们针对四种粘附蛋白进行了浓度测试，包括高浓度（1μM Kindlin、1μM Talin、1μM Paxillin和200nM FAK）和低浓度（0.2μM Kindlin、0.2μM Talin、0.2μM Paxillin和40nM FAK），以不同的离子强度考验体外溶液的征象。
在高浓度（C蛋白质）条件下，我们不雅观察到蛋白质缩合物的形成，表现为溶液的浊度增加。
随着KCl浓度的增加，溶液的浊度逐渐降落，而在低浓度条件下，没有不雅观察到蛋白质引起的溶液浊度变革。
这种浊度的浓度和KCl依赖性征象确认了测试的粘附蛋白组的相分离是由蛋白质浓度和溶液中的静电相互浸染共同驱动的。
我们对整合素细胞质β1代表进行了研究，以探究同类或依赖于Talin的整合素聚拢所需的最小构造域。
在0%和5%磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）支持的脂质双层中重新构建了膜，加入了β1整合素。
在高浓度条件下，与Kindlin、Talin、Paxillin和FAK一起孵育后，β1簇同时涌如今0%和5% PIP2上。
无论是低离子强度（50mM KCl）还是生理离子强度下，这表明在高浓度条件下，蛋白质会在膜上形成蛋白质复合物。
通过Kindlin和Talin与β1整合素相互连接，从而促进了β1在膜上的聚拢。
光漂白后的荧光规复（FRAP）丈量显示，β1簇是动态组分，β1在膜上自由扩散和交流。
只管在高浓度条件下，蛋白质会引起β1簇的涌现，但其密度受到离子强度和PIP2的调控，在没有PIP2的情形下，β1簇的密度在150mM KCl存不才比50mM KCl条件低落低了两倍。
这些差异表明在没有PIP的膜上，β1的聚拢受到本体溶液中离子强度的调节，这种离子强度的调控影响了被测粘附蛋白的相分离。
与此形成光鲜比拟的是，在1% PIP的情形下，β5簇的密度对膜的影响不受高达150mM KCl的离子强度的影响，与没有PIP的膜比较，其密度增加了五倍，表现出高离子强度的特点。
在1% PIP的情形下，β5簇密度只有在较高的非生理离子强度下会降落。
在没有附着的β1情形下，蛋白质缩合物在高蛋白质浓度的脂质膜上也会形成，标记有Kindlin或FAK，对PIP的依赖性浓度相同，但密度较低。
结果表明，β1和脂质膜的组成增强了预成型蛋白质缩合物与膜的结合，而膜的组成是主导成分。
为了更进一步评估Kindlin和Talin对β1的影响，我们比较了在β1孵育1分钟后和用缓冲液冲洗后的情形。
在第一组实验中，我们单独将0.1至2μM的Kindlin或Talin与模型膜一起孵育，然后在0% PIP上进行冲洗，在冲洗后，与单独β1的扩散比较，β1与Kindlin或Talin共同孵育的情形下扩散的情形基本相同。
这表明缓冲液的冲洗已将大部分Kindlin或Talin从溶液中去除。
总体而言，在5% PIP的情形下，与Kindlin或Talin一起孵育的β1的扩散韶光明显长于0% PIP上的情形，这表明Kindlin可以在1% PIP上与β1形成稳定的合营物膜，扩散韶光在两小时内保持不变。
显示出这些复合物的高稳定性，与Kindlin和Talin同时孵育导致在PIP存不才形成更大的β1复合物。
从冲洗后扩散韶光的增加可以看出，这些复合物导致β1的扩散速率比在2% PIP上没有Kindlin或Talin的情形下慢1.5倍。
此外，Kindlin和Talin的二聚化可能在β1复合物的形成中起浸染。
这些复合物仍旧是可移动的，虽然较小，在1% PIP的情形下，形成了β1-Kindlin、β1-Talin和β5-Kindlin-Talin的合营物膜。
这匆匆使我们研究PIP如何在膜上召募Paxillin和FAK，形成最小的整合素粘附复合物。
«——【 ·结论· 】——»
蛋白质在溶液中的相分离征象受到多价相互浸染蛋白质的浓度和体溶液条件的影响，如离子强度、pH和温度等,繁芜的凝聚体。
包含数十乃至数百种身分，横跨了一个具有多维相互依赖性的相空间：个中一个组分的相边界取决于其他组分的浓度。
因此，相分离征象可以通过改变溶剂条件或者调度组分浓度来勾引。
我们在这里证明了脂质膜的复合表面能够驱动与膜干系的蛋白质缩合物的形成，膜表面实际上为蛋白质溶液设定了一种局部的溶剂条件。
局部膜组成、通过脂质或蛋白质磷酸化的旗子暗记传导，以及顺序蛋白质结合的相互浸染为理解粘附复合物的形成机制供应了主要的框架。
参考文献
【1】莫泽 M.，《通过塔林、金德林和机器力激活整合素》
【2】坎贝尔 I. D.， 《整合素构造、激活和相互浸染》
【3】郭树生， 《整合素介导的机器转导》
【4】《肌动蛋白和α-肌动蛋白以肌球蛋白II运动非依赖性的办法折衷新生粘连的组装和成熟》
