MicroRNA（miRNA）是一类在真核生物中广泛存在的约22个核苷酸长度的内源单链非编码RNA分子。自2002岁首年月次创造植物miRNA以来，miRNA迅速成为植物分子生物学领域的研究热点。数十年的研究表明，miRNA在植物成长发育、旗子暗记转导、环境胁迫相应和次生代谢产物形成等方面发挥着重要的调控浸染，因此开展miRNA的干系研究具有非常主要的意义。正所谓“工欲善其事，必先利其器”，本期伯小远就带着大家一起盘点一下miRNA的研究方法，希望对大家的科研有所帮助！
1.miRNA的背景先容
在正式学习有关miRNA的研究方法之前，小远想和大家一起回顾一下有关miRNA的背景知识。
1.1 miRNA的生物发生过程
植物miRNA的生物发生过程紧张包括miRNA的转录、miRNA前体的剪切、miRNA的甲基化和miRNA勾引沉默复合体（RISC）的形成等几个紧张过程。首先，细胞核中编码miRNA的基因在RNA聚合酶II的浸染下转录形发展度约为几百个核苷酸的低级转录物，随后在其5'端进行加帽，并在其3'端进行聚腺苷酸化，并折叠形成低级miRNA（primary miRNA, pri-miRNA），然后在DCL、HYL1和SE等核心组分组成的剪切复合体的浸染下形成miRNA的前体（precursor mRNA, pre-miRNA），pre-miRNA会被连续剪切形成双链miRNA。接着在miRNA甲基转移酶HEN1的浸染下，双链miRNA的3'末端发生甲基化润色，从而抑制miRNA的降解。末了，双链成熟miRNA的一条链会加载到RISC中，而另一条链则会被降解（图1）。
图1 植物miRNA生物发生的紧张过程(Deng et al., 2022)。
1.2 miRNA的调控模式
在植物中，miRNA紧张通过剪切mRNA和抑制翻译两种办法对靶基因进行负调控（图2）。个中，miRNA对mRNA的剪切紧张通过ARGONAUTE（AGO）蛋白的核酸内切酶活性来发挥浸染。成熟的miRNA可以与AGO蛋白组装成RISC复合体，miRNA通过识别与自身核苷酸互补配对的靶基因mRNA并与之结合后，AGO1可以特异性地在miRNA第10~11位对应的靶基因mRNA的位置割断核苷酸之间的磷酸二酯键，产生两段切割产物，随后mRNA 5'和3'端片段会进入核酸外切酶降解路子。须要把稳的是，有些被miRNA剪切的mRNA片段除了进入核酸外切酶降解路子以外，还有可能产生具有一定相位的siRNA（phased siRNAs, phasiRNA）。
由于植物蛋白抗体开拓不敷，限定了对miRNA靶基因蛋白水平的检测，加之miRNA对靶基因mRNA剪切的研究被大量宣布，在很长一段韶光内，研究职员都认为植物miRNA紧张通过剪切靶基因mRNA发挥浸染。随着越来越多的研究表明有的植物miRNA并不影响靶基因mRNA的水平，而是降落靶基因蛋白的水平，由此提出植物miRNA也存在与动物miRNA类似的抑制蛋白翻译的浸染。其大致机制是，成熟的miRNA与AGO1等干系功能蛋白结合后形成复合体，借助内质网上的ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1）等蛋白定位到正在翻译的靶基因mRNA上，阻挡核糖体的组装及翻译，不过该机制还须要更加深入的研究（张翠桔等，2020）。
图2 植物miRNA浸染模式概述(Yu et al., 2017)。
1.3 有关miRNA的其他知识点
对付初次打仗miRNA的小伙伴来说，在阅读文献时肯定被miRNA的名字困扰到吧，大家一定很奇怪为啥文中涌现了几种不同的写法？小远第一次看文献的时候也是一头雾水，以是专门去查了miRNA的命名规则来和大家一起分享。下图是miRBase的miRNA命名规则（图3），目前miRNA的命名基本遵照这个规则，当然在命名规则确定之前创造的miRNA还保持原来的名字。
图3 miRNA的命名规则（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
除了被miRNA的命名搞得一头雾水外，大家是不是也曾分不清siRNA、shRNA和miRNA，尤其是siRNA和miRNA，由于它们有许多相同之处，对付刚打仗miRNA研究的小伙伴来说，很随意马虎把它们混为一谈，关于这三种RNA的详细先容，大家可以查阅小远的往期文章“siRNA、shRNA和miRNA，还在傻傻分不清？”进行学习哦。
2. miRNA的基本研究思路
在开展miRNA的干系研究前，首先是要确定待研究的miRNA，大家一样平常可以结合已有的生物学征象，对实验组/对照组进行miRNA-seq探求差异的miRNA，或者通过查阅文献资料以及数据库信息来确定待研究的miRNA。确定好要研究的miRNA后可以通过构建过表达载体/沉默载体，结合稳定转化/瞬时转化实验来验证miRNA的生物学功能。其余，还可以通过生物信息学预测结合降解组测序、5' RLM-RACE、荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹等实验确定miRNA的靶基因，并综合解析miRNA-靶基因-表型三者之间的调控关系。
3. miRNA研究的干系技能方法
3.1 miRNA-seq
miRNA-seq是为了检测miRNA的表达情形发展起来的高通量测序方法。由于miRNA的序列很短，因此建库时可以直接添加接头，进行逆转录扩增，通过PCR扩增并添加测序接头，然后纯化特定例模的DNA片段，进行上机测序，结合数据剖析可以理解miRNA的表达情形（图4）。
图4 miRNA测序实验流程图。
文献案例
2023年6月，Wang等人在Frontiers in Plant Science杂志上揭橥了一篇题为“Integrated transcriptome and microRNA sequencing analyses reveal gene responses in poplar leaves infected by the novel pathogen bean common mosaic virus (BCMV)”的研究论文，宣布了菜豆花叶病毒（BCMV）对杨树的影响以及杨树相应病毒传染的分子机制。在该论文中，作者利用RNA-seq和miRNA-seq剖析揭示了杨树患病叶片中差异表达的基因以及miRNA。个中，miRNA-seq数据剖析显示在短期病叶（SD，有新涌现的轻微花叶症状）中共鉴定到84个差异表达的miRNA，在长期病叶（LD，具有范例且显著的花叶症状）中共鉴定到89个差异表达的miRNA。这些差异表达的miRNA中有78个是已知的，它们属于21个miRNA家族，个中miR156是最大的家族，有12个成员，其次是miR395和miR167等。结果还显示，属于同一家族的miRNA在SD和LD叶片中具有相同的表达模式。随后，作者利用TargetFinder进一步预测了这些miRNA的靶基因，在SD叶片中共预测到2079个目标基因，而在LD叶片中预测了1656个目标基因。预测基因的KEGG剖析表明，SD叶片中没有代谢路子显著富集，而LD叶片中显著富集的代谢路子是过氧化物酶体通路和异喹啉生物碱的生物合成通路（图5）。
图5 杨叶染病叶片中差异表达基因（DEGs）和差异表达miRNA（DEMs）的维恩图和KEGG旗子暗记通路富集剖析图(Wang et al., 2023)。（A）杨树染病叶片中DEGs的维恩图；（B、C）SD叶片和LD叶片中DEGs的KEGG旗子暗记通路富集剖析图；（D）杨树染病叶片中DMEs的维恩图；（E、F）SD叶片和LD叶片中DMEs的KEGG旗子暗记通路富集剖析图。
3.2 miRNA的过表达
对目的miRNA进行过表达研究，首先须要找到目的miRNA的前体序列（pre-miRNA），再构建强启动子驱动pre-miRNA表达的过表达载体（图6），然后根据自己的实验目的进行稳定转化或瞬时转化，从而研究miRNA的生物学功能。
在此推举几个探求miRNA前体序列的网站：
（1）miRBase：
http://microrna.sanger.ac.uk；
（2）PmiRKB：
PmiRKB Homepage (http://zju.edu.cn)；
（3）RNAcentral：
https://rnacentral.org/search?q=sbi-MIR156d。
图6 miRNA过表达载体构建示意图（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
3.3 miRNA的沉默
除了对miRNA进行过表达外，沉默miRNA也是解析其生物学功能的常用方法，在本次推文中小远紧张先容两种沉默miRNA的方法，它们分别是短串联靶标仿照（Short tandem target mimic，STTM）技能和CRISPR/Cas9技能。
3.3.1 STTM
STTM可以在植物体内特异地勾引miRNA的降解，从而降落内源miRNA的水平。该技能的事理是人工合成一段短串联靶标仿照物，中间有一段48nt旁边的特定核苷酸序列，两端分别含有目标miRNA结合位点，每段miRNA结合序列包括3个非互补碱基（CTA），该序列能与目标miRNA结合形成非完备互补双链，从而有效地阻挡miRNA与靶基因mRNA的结合（图7）。
图7 STTM166-48的载体设计谋略（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
3.3.2 CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9技能也可以被用于部分miRNA的基因编辑及功能解析。利用该技能对MIR基因序列进行编辑时，sgRNA一样平常设计在成熟miRNA或前体茎环构造所在的位置，从而实现敲除miRNA的目的，但是由于受到PAM序列的限定，在实际研究中不一定存在得当的sgRNA(Deng et al., 2022)。
2020年7月，Bi等人在Plant Biotechnology Journal杂志上揭橥了一篇题为“Disruption of miRNA sequences by TALENs and CRISPR/Cas9 induces varied lengths of miRNA production”的研究论文。在该论文中作者利用CRISPR/Cas9技能对拟南芥的MIR160a进行了基因编辑，通过在miR160a和miR160a链上分别设计gRNA，并构建含有这两个gRNA的载体，结合遗传转化终极成功得到了大片段缺失落的突变体（图8）。
图8 利用CRIPSR/Cas9对拟南芥MIR160a进行基因编辑(Bi et al., 2020)。（a）含有双gRNA的CRISPR/Cas9的设计。miR160和miR160a链以粗体和下划线表示。PAM和双链断裂 （DSB）位点均已标记。gRNA和基因组DNA之间的配对序列用蓝色和橙色标记。产生的47或48bp片段删除如下所示。（b）两周龄的野生型和mir160a‑△47植株。（c）mir160a‑△47突变体花的表型。（d）野生型和mir160a‑△47突变体相同发育阶段的果荚表型。（e）野生型和mir160a‑△47突变体的种子，蓝色箭头表示发育延迟或中止的种子，白色箭头表示未受精的胚珠。
3.4 miRNA的检测
对miRNA进行过表达/沉默后，须要通过检测miRNA的水平来判断实验是否成功。由于miRNA不能翻译成蛋白，以是就只能在转录水平上进行检测。目前用于检测miRNA表达的方法包括定量PCR、Northern blot、微阵列和RNA测序等，个中比较常用的方法是定量PCR和Northern blot。须要把稳的是，由于成熟miRNA序列较短，用定量PCR检测时，须要通过茎环法或加尾法延长成熟miRNA的序列才能进行定量。有关miRNA检测方法的详细描述以及miRNA过表达、沉默、检测的文献案例，大家均可以在小远的往期文章“没有什么不同——非编码RNA的研究方法（一）”中进行查阅哦！
3.5 miRNA靶基因的预测与验证
3.5.1 生物信息学预测
通过生物信息学的方法预测miRNA的靶基因可以为后续的功能研究供应主要的线索。由于植物miRNA与靶基因mRNA险些因此完备互补配对的办法结合，预测时无需繁芜的算法，因此植物miRNA的靶基因预测相比拟较随意马虎一些。以下是一些常用的预测网站，详细的用法大家可以查询这些网站的操作解释进行学习。
（1）psRNATarget：
http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/
（2）TAPIR：
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/tapir/
（3）miRdeepFinder：
http://www.leonxie.com/DeepFinder.php
（4）psRobot：
http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php
（5）WMD3：
http://wmd3.wei http://gelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi
须要把稳的是通过生物信息学预测的靶基因存在一定的假阳性，miRNA是否可以靶向剪切或抑制靶基因的表达终极仍须要采取生物学实验进行验证哦。
3.5.2 降解组测序技能
降解组测序，又称为大规模平行末端剖析，是利用高通量测序技能对被剪切的mRNA片段进行测序剖析，准确高效地筛选miRNA靶基因的方法(German et al., 2008)。其事情事理是基于miRNA与靶基因mRNA互补配对后，会在互补位点的第10或11位核苷酸上发生剪切浸染产生2个片段。个中，5'剪切片段包含5'帽子构造和3'羟基；3'剪切片段则包含自由的5'单磷酸和3' polyA尾巴。利用只与5'单磷酸RNA连接的分外接头5' adapter捕获miRNA的剪切产物。随后将捕获到的3'剪切片段反转录成cDNA并扩增，利用限定性内切酶对扩增产物进行酶切，将得到的酶切片段与3'双链DNA adapter连接并进行扩增纯化后，可以建立文库用于后续的高通量测序（图9）。通过对测序数据进行剖析，能够直不雅观的创造mRNA的某个位点会涌现一个波峰，该处正是候选的miRNA剪切位点(董淼等，2013)。
利用降解组测序，大家可以通过实验来探求miRNA的靶基因，使得数据的准确性和说服力大幅提高，因而该技能也成为了miRNA靶基因鉴定的一大利器，不过该技能不能检测通过影响翻译抑制靶基因表达的miRNA。
图9 降解组测序文库的构建(董淼等，2013)。
文献案例
2022年6月，Liu等人在Plant Physiology杂志上揭橥了一篇题为“Maize miR167-ARF3/30-polyamine oxidase 1 module-regulated H2O2 production confers resistance to maize chlorotic mottle virus”的研究论文，揭示了Zma-miR167-ZmARF3/30模块通过调节ZmPAO1的表达来抑制玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）传染。在该论文中，作者为了探求Zma-miR167的靶标，首先利用WMD3和TargetMiRna这两个在线工具进行了初步的预测，结果表明ZmARF3、ZmARF9、ZmARF16、ZmARF18、ZmARF22、ZmARF30和ZmARF34均含有Zma-miR167的结合位点，在进行生物信息学预测时作者之以是重点关注ZmARF，是由于先前的研究宣布表明miR167可以靶向ARF基因从而调节各种生物过程(Varaud et al., 2011; Kinoshita et al., 2012; Barik et al., 2015; Wang et al., 2015; Na et al., 2019; Song et al., 2019; Yao et al., 2019)。随后，作者对从Zma-miR167过表达株系（OE2）和滋扰株系（CMV-STTM167）中提取的总RNA进行降解组测序，结果显示ZmARF3和ZmARF30各有一个峰值，表明Zma-miR167在其上有一个剪切位点。而其他被预测为Zma-miR167靶标的ZmARF基因并未检测到明显的剪接峰。其余，作者还通过5'-RNA连接酶介导的cDNA末端扩增实验（RLM-RACE）进一步证明ZmARF3和ZmARF30可以被Zma-miR167直接靶向（图10）。
图10 ZmARF3和ZmARF30会被Zma-miR167剪切(Liu et al., 2022)。（A）降解组测序显示Zma-miR167靶标上有剪切位点，赤色箭头表示该位点的降解峰；（B）检测到具有Zma-miR167剪切位点的ZmARF3和ZmARF30的降解产物。玄色箭头表示降解位点。核苷酸峰图对应扩增片段。
3.5.3 5' RLM-RACE
5' RLM-RACE常被用于检测植物miRNA的剪切位点，其检测事理与降解组测序相似，是利用T4 RNA连接酶在mRNA的3'剪切片段的5'端连上一个人工合成的RNA接头，由于完全mRNA的5'端有帽子构造因此不能与RNA接头相连。然后用随机引物进行反转录，接着用接头上的内外两层锚定引物和基因下贱的两个特异性引物进行巢式PCR，末了将扩增产物连接到克隆载体上进行测序，将测得的片段与靶基因序列比对即可确定miRNA是否剪切靶基因mRNA及剪切位点(郑小宇等，2021)。
文献案例
2023年3月，Pei等人在Horticultural Plant Journal杂志上揭橥了一篇题为“Identification, characterization, and verification of miR399 target gene in grape”的研究论文，阐明了葡萄miR399家族的进化特色并验证了其对靶基因mRNA的切割效果。在该论文中，作者为了探求葡萄miR399的靶基因，首先利用psRNATarget进行靶基因预测，结果表明miR399家族的成员均可靶向VIT_13s0067g03280（inorganic phosphate transporter 1-3）。此外，VIT_12s0035g00200（phospholipase D delta-like）、VIT_12s0059g02000（beta-glucuronosyltransferase GlcAT14A）等也是大多数miR399成员的靶标。基于先前的研究宣布，在“Kyoho”和“Fengzao”葡萄转录组的整体比较中，只有vvi-miR399b存在差异表达(Guo et al., 2018)。因此，作者选择vvi-miR399b来验证其对靶基因mRNA的剪切浸染，首先利用双荧光素酶报告基因检测系统检测创造vvi-miR399b可以浸染于inorganic phosphate transporter 1-3、phospholipase D delta-like以及beta-glucuronosyltransferase的靶位点，并对靶基因有调节浸染（图11 A、B）。接着，作者利用5′ RLM-RACE实验做了进一步的验证，结果显示vvi-miR399b对靶基因的剪切紧张发生在vvi-miR399b与靶基因mRNA互补区域的第10或第11位核苷酸上（图11 C）。
图11 验证葡萄miR399对其靶基因的剪切效果(Pei et al., 2023)。（A）双荧光素酶载体示意图；（B）Luc/Ren比值（WT表示vvi-miR399b靶序列；MUT表示突变的vvi-miR399b靶序列）；（C）用于验证靶基因预测的5′ RLM-RACE实验结果。
3.5.4 RT-qPCR与蛋白免疫印迹
miRNA负调控靶基因的结果是靶基因mRNA水平和蛋白水平低落（或仅蛋白水平低落）。因此，可以利用RT-qPCR和蛋白质免疫印迹进一步验证通过生物信息学等手段创造的靶基因。通过检测过表达或抑制miRNA表达前后植物体内靶基因的mRNA和其编码蛋白表达量的变革，可以确定miRNA与靶基因的调控关系。不过，由于植物中高质量的抗系统编制备比较困难，以是蛋白免疫印迹的运用会相对较少一些。
由于没有检索到比较得当的文章，小远在此只列举一个利用RT-qPCR验证miRNA靶基因的案例，大家如果对蛋白免疫印迹比较感兴趣的话，可以自行查阅文献，也欢迎大家把文献分享给小远！
文献案例
2023年8月，Xu等人在New Phytologist杂志上揭橥了一篇题为“Intronic microRNA-directed regulation of mitochondrial reactive oxygen species enhances plant stress tolerance in Arabidopsis”的研究论文，宣布了在镉（Cd）胁迫条件下，pre-miR400发生内含子保留，导致miR400的水平低落，其下贱靶基因PPR1的表达上调，ROS（活性氧）积累减少，引起轻微的氧化损伤。在该论文中，作者首先利用生物信息学找到了两个miR400的靶基因PPR1和PPR2，为了进一步探究miR400的调控网络，作者在miR400过表达株系（OxmiR400）和miR400滋扰株系（STTM400）中检测了PPR1和PPR2的相对表达水平（图12），结果显示在OxmiR400中PPR1和PPR2的表达水平低落，而在STTM400中的表达水平上升，解释miR400可以靶向PPR1和PPR2。
图12 通过RT-qPCR测定的WT、OXmiR400和STTM400植物中PPR1（a）和PPR2（b）的相对表达水平。
小远叨叨
文章至此就告一段落了！
在本期的推文中小远紧张是和大家一起回顾了miRNA的根本知识，并总结了miRNA的一样平常研究思路和干系的技能方法，希望本次推文对刚打仗miRNA以及正在做干系研究的小伙伴们都有一定的启示，当然，文中总结不到位的地方也欢迎大家和小远沟通互换哦！
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